ポリメラーゼ連鎖反応

ポリメラーゼ連鎖反応（英：Polymerase Chain Reaction、PCR）は、DNAの必要な部分を複製・増幅させる分子生物学的な技術である。この技術は、人のゲノムのような非常に複雑であり、量が極めて微量であるDNA溶液からの研究者が希望する特定のDNA断片のみを選択的に増幅させることができる。また、増幅に必要な時間が2時間程度短く、実験の過程が単純で、全自動機械で増幅することができるので、PCRと、ここで得られた様々な技術は、分子生物学、医療、犯罪捜査、生物の分類などのDNAを扱う作業全体で極めて重要な役割を担っている。

1984年にキャリー離れス特定DNA配列を増幅するための方法を考案してポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction）と呼んだ。 1985年にポリメラーゼをクレナウポリメラーゼ（Klenow polymerase）で使用するPCRは、最初正式に発表された。クレナウポリメラーゼは熱に弱いたので、1サイクルごとに酵素を新たに入れなければなりませし、生成物の最大長さは400bpに過ぎなかった。 1988年にDNAポリメラーゼでThermophilus aquaticusという微生物（極好熱菌）のDNAポリメラーゼであるTaqを使用した論文が出された。熱に強いこのポリメラーゼは、PCRの効率を格段に引き上げた。

PCRには、一連の三つの段階があり、30〜40回程度繰り返される。 PCRの最初のステップは、DNAを変性（Denaturation）させるものである。二本鎖のDNAは、加熱することにより、分離させることができる。分離された各DNAは鋳型（Template）としての役割をすることになる。変性温度は、DNA内のG + Cの量とDNAの長さに応じて変わる。 PCRの第二段階は、結合（Annealing）である。この段階では、プライマー（Primer）が鋳型DNAに結合することになる。結合（Annealing）温度は、反応の正確さを決定する重要な要素であるが、もし温度が高すぎると、プライマーが鋳型DNAにも弱く結合されて増幅されたDNAの産物が非常に少なくなる。また、もし温度が低すぎると、プライマーが非特異的に結合するため、望ましくないDNAが増幅されることができる。 PCRの第三段階は、腎臓（Elongation）段階である。この段階では熱に強いDNAポリメラーゼが鋳型DNAから新しいDNAを作ることになる。

PCRは、DNA、RNAレベルのPCRに分割することができる。通常の遺伝子を得る実験を行う場合には、その遺伝子の全体を表示するのではなく、遺伝子の中での特定の遺伝子を観察することが目的である。しかし、DNAを直接PCRにされると、特定の遺伝子を得る大変真核生物の場合には、イントロン（Intron;非発現部位）が一緒に出てくるなど、さまざまな問題点がある。それを解決するために、特定の遺伝子のプライマーをつけた後、PCRをDNAレベルではなくRNAレベルでするレトロ-PCR（RT（Reverse Transcriptase）-PCR）がある。最近では、反応の結果を最大限にするために、Taqポリメラーゼだけでなく、いくつかの会社で独自に開発した複合酵素を使用することもある。

DNAの変性（Denaturation）

92°C〜95°Cに加熱して二本鎖DNAを一本鎖DNAに分離させる。高温であるほど、一本鎖DNAによく移行しますが、Taq DNAポリメラーゼも温度が非常に高い状態では、変性されて使用できなくなることがありますので、通常は94°Cとする。

プライマーの結合（Annealing）

50°C〜65°Cで行われる。プライマーが自分の塩基配列と相補的な塩基配列を持っているDNAに結合する段階である。塩基間の結合は、GとCは三箇所で水素結合が起こり、AとTは二つの結合が起こるので、G-C結合が、A-T結合よりも強い。したがってG + Cの割合に応じて、結合温度に変化を与えるのが良い。一般的に、G-C contentが50％となるプライマー対を用いることが好ましい。通常30秒ほど持続され、この段階で5 '→3'の方向にDNAの合成が開始される。

DNAの伸長（Extension）

70°C〜74°Cで実施したいPCR産物のサイズが大きかったり反応酵素の濃度が低いときには、時間を延長させることもできる。 Taqポリメラーゼは、通常1分に2,000-4,000塩基対を重合することができますので、必要なPCR産物のサイズ1kbごとに1分程度の時間を配当する十分な反応が起こる。最後cycleは約10分程度の時間を十分に与えることが良い。

このプロセスが繰り返さして進行されながら（通常20〜40回）、DNAの必要な部分を増幅させることがPCRの原理である。

必要な部分をしっかりと増幅させたかを確認するために、PCR産物のサイズを比較することができるアガロースゲル電気泳動を利用するのが一般的である。 PCR産物のサイズは、DNA ladderと呼ばれるものの比較を介して大まかに知ることができる。