dCas9有効システム

CRISPR有効（CRISPRa）はdCas9またはガイドRNA（gRNA）に転写活性化私が追加されたエンドヌクレアーゼ活性がないCas9の突然変異であるdCas9の変形されたバージョンを使用するCRISPRツールのタイプです。標準CRISPR-Cas9システムのように、dCas9有効システムは、遺伝子の調節または変形のためのCas9変異体、Cas9を意図された目標と案内するためのgRNA、および細胞への導入のためのベクターのような類似した成分に依存する。しかし、標準的なCRISPR-Cas9システムはCas9のエンドヌクレアーゼ活性を介してDNAから切断を作成して、遺伝子編集のためのDNA修復機構を操作することに依存するdCas9有効システムは、変形されて転写活性化剤を使用して、関心のある遺伝子の発現を増加させる。これらのシステムは、遺伝子スクリーン、関心のあるタンパク質の過発現を含むがこれらに限定されない多くの目的のために使用可能である。

コンポーネント
dCas9
死んだCas9またはdCas9も知られているCas9エンドヌクレアーゼデッドはエンドヌクレアーゼドメインで点突然変異を介してエンドヌクレアーゼ活性が除去されたCas9の突然変異形態である。変異されていない形態と同様に、dCas9はgRISとCRISPRシステムで使用されてCas9が結合できるようにするPAM配列を有するgRNAに相補的な特定の遺伝子またはヌクレオチドを目標とする。 Cas9は通常RuvCとHNHドメインと呼ばれる2つのエンドヌクレアーゼドメインを有している。点突然変異D10AとH840Aは2つの重要な残基を変化させるにはもヌクレアーゼ活性の結果として、最終的に異議不活性化をもたらす。 dCas9はエンドヌクレアーゼ活性が欠如しているが、そのような結合は、他のドメインによって管理されるため、標的化されたガイドRNAとDNA鎖にまだ結合することができる。 gRNAが転写因子とRNAポリマーと私DNAにアクセスすることを防止する方法でdCas9を位置させる場合には、これだけで標的遺伝子の転写を完全に遮断しなければ弱体化されるのに十分である。しかし、dCas9が転写活性化剤を付着するのに使用できる変形可能な領域、典型的には、タンパク質のNおよびC末端を有するため、DNAに結合するこれらの能力は、活性化のために使用することができる。

ガイドRNA
参照：RNAガイド、CRISPR

小さなガイドRNA（sgRNA）、またはgRNAはCas9またはdCas9を彼らのターゲットに向けに使用される約20個のヌクレオチドを有するRNAである。 gRNAはCRISPRシステムに重要な二つの主要な領域であるスキャフォールドとスペーサー領域を含みます。スペーサー領域は、多くの場合、プロモーター領域で標的遺伝子の発見されたものと相補的なヌクレオチドを持つ。スキャフォールド領域は（d）Cas9と複合体形成を担当する。一緒に、彼ら（d）Cas9に結合して、これを、関心のある遺伝子（複数可）に送る。 gRNAのスペーサー領域は、任意の潜在的な序列に変形することができるので、スペーサー領域に相補的な配列を有する任意の遺伝子とヌクレオチドが可能な標的となる可能性があるため、CRISPRシステムに多くの柔軟性を提供する。

sgRNAとゲノムDNAとの間の補完的な塩基対でCas9またはdCas9の標的化可能
転写活性化第
参照：転写活性化剤、転写因子

転写活性化剤は、システムによって標的化される遺伝子（s）の転写のためのRNAポリメラーゼだけでなく、重要な補助因子の動員を助けるdCas9またはsgRNAに接続されたタンパク質ドメインまたは全体のタンパク質である。タンパク質をコードする遺伝子からタンパク質を製造するためには、RNAポリマーと私前に消え呼ばれる過程で、遺伝子のDNA鋳型からRNAを作成します。転写活性化剤は、DNA結合ドメインと転写活性化のためのドメインを持つ。有効ドメインは、一般的な転写因子またはRNAポリメラーゼをコードする遺伝子配列に動員することができる。有効ドメインはまた、停止されたRNAポリメラーゼによる転写を促進することにより機能することができ、真核生物で移動するように作用することができる遺伝子発現を増加させるためにDNA上のヌクレオチド綿またはヒストンを変形させる。 [2]このdCas9活性剤やsgRNA付きでシステムに導入することができる。一部の研究者は、全社的な上方調節の程度は、一つの実験で有効製取付のために、多数の部位を使用して、指定された実験やサンプルで一度に異なる変形剤及び活性化剤の組み合わせを使用することにより、調節することができると指摘した。

表現システム
発現システムは、目的の細胞内gRNAsと（d）Cas9タンパク質の導入を要求する。典型的に使用されるオプションは、プラスミド、ウイルスベクター、例えば、アデノ - 関連ウイルス（AAV）ベクターまたはレンチウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。